甘蔗是中国及世界上最为重要的糖料作物。蔗糖占到中国食糖总量的90%以上。甘蔗品种改良对于保障中国食糖供应具有重要的地位和作用。割手密(Saccharum spontaneum L.)，又称甘蔗细茎野生种，是甘蔗近缘野生种之一，也是甘蔗栽培种(Saccharum spp.)的重要亲本之一，具有耐旱、耐贫瘠、抗逆性强等特点，在甘蔗改良中具有重要的作用(Bremer, 1961)。19世纪初，Jesweit、Barber等通过热带种与割手密的杂交利用，育成了POJ、CO等系列高产、高糖种质，为此后的世界甘蔗育种奠定了良好的基础(D'Hont et al., 1996; Grivet et al., 1996)。当前，世界范围内种植的甘蔗栽培品种几乎都含有割手密的遗传成分，甘蔗栽培种中约10%的染色体来自于割手密(Sreeinivasan et al., 1987)。由于割手密在甘蔗改良中具有重要作用，世界各甘蔗主产国都非常重视割手密种质资源收集、评价与利用研究(Mary et al., 2006; Pan et al., 2004; Zhang et al., 2010)。早在2001年，Tai和Miller (2001)就构建了美国保育的来自世界各地的割手密的核心种质。印度是割手密的起源地之一，Mary等(2006)应用ISSR等分子标记分析了不同地理来源的割手密的遗传多样性；Amalraj等(2006)利用10个质量性状和21个数量性状构建了印度割手密种质资源的核心种质。

中国是割手密的原产地之一，主要分布在北纬18°~33°、东经97°~122°的地区(Chen and Phillips, 2006)。从上世纪50年代以来，就已开展割手密与热带种、栽培种之间的杂交利用研究。经过几十年的杂交与回交，由广州甘蔗糖业研究所选育的具有中国本土割手密血缘的崖城系列亲本已经成为主要甘蔗亲本系统之一(邓海华等, 2004; 劳方业等, 2008)，育出了一系列优良品种(张琼等, 2009)。为了促进割手密种质资源的保护和利用，科研人员对广西(Zhang et al., 2010)、四川(Chang et al., 2012)、云南(杨清辉和何顺长, 1993)等地区的割手密种质资源进行了相关研究和报道。

广东是中国重要的甘蔗种植区域之一，具有丰富的割手密资源(齐永文等, 2009)。近年来，随着广东工农经济的快速发展，一些原有的割手密生存地不断得到开发，许多地区的割手密正在迅速的减少或消失，迫切需要加强资源的收集与保护。但是，目前有关广东地区割手密种质资源的研究还较少，在资源收集时和利用时存在一定的盲目性。因此，本研究采用SSR标记对来自广东不同地区的割手密的遗传多样性进行分析，研究广东割手密种质资源的遗传多样性及其地理分布，为割手密种质种质资源收集、保护与创新利用提供参考。

1结果与分析
1.1广东割手密在SSR位点上的遗传多样性
67份广东割手密在20对SSR引物上共检测到417个条带(表1)，其中341个为多态性条带，多态性比例为81.8%。每个位点上的多态性性条带数为4~34个，平均为17.05个。其中，11对Genomic-SSR引物共检测到229个多态性条带，平均多态性为20.82；9对EST-SSR引物共检测到112个多态性条带，平均多态性为12.44。与Genomic-SSR相比，EST-SSR的多态性较低，在所分析的20对引物中，多态性条带数低于10的5对引物中4对引物为EST-SSR，1对引物是Genomic-SSR，EST-SSR的平均多态性条带数只有Genomic-SSR的59.8%。

表1 广东割手密在SSR引物上的扩增条带数、多态性条带数、多态性比例和基因多样性指数和多态性信息含量 Table 1 The number of total bands, polymorphic bands, percent of polymorphic bands, genetic diversity index and polymorphic information content (PIC) among the Guangdong Geshoumi (S. spontaneum) based on SSR

67份广东割手密在20对引物上的遗传多样性指数介于0.106 4~0.291 7之间，平均遗传多样性指数为0.193 4。其中在11对Genomic-SSR引物上的平均遗传多样性指数为0.190 8，在9对EST-SSR引物上的平均遗传多样性指数为0.196 4，EST-SSR引物上的平均遗传多样性指数略高于Genomic-SSR的平均遗传多样性指数。11个Genomic-SSR位点的平均PIC值为0.158 1，9个EST-SSR位点上的平均PIC值为0.162 4，EST-SSR的多态性信息含量也略高于Genomic-SSR。

1.2 Genomic-SSR和EST-SSR遗传矩阵比较
我们分别统计了Genomic-SSR和EST-SSR两种类型SSR引物计算的各个实验材料间的遗传距离。其中67份广东割手密在11对Genomic-SSR引物上的遗传距离介于0.006 8~0.284 7之间，平均遗传距离为0.196 1。在9对EST-SSR引物的遗传距离介于0.006 3~0.348 2之间，平均遗传距离为0.191 0。Mantel Test分析表明采用Genomic-SSR获得各个实验材料的遗传矩阵和采用EST-SSR获得遗传矩阵之间呈极显著相关(r=0.537 9, p<0.01)。此外，采用Mantel Test统计了单独采用一种类型SSR和同时采用两种类型SSR获得实验材料遗传距离矩阵之间的相关性，结果表明通过Genomic-SSR和EST-SSR获得遗传矩阵与通过Genomic-SSR+EST-SSR获得的遗传距离矩阵之间的相关系系数分别为0.935 0和0.801 9，也都达到极显著相关水平(p<0.01)。由此可见，通过两种不同类型SSR获得的材料间的遗传关系具有较高的一致性。

1.3广东割手密种质资源聚类分析
本实验中，67广东割手密之间的遗传距离介于0.006 3~0.348 2之间，平均为0.193 5。为了分析种质间资源遗传距离是否与地理之间存在关系，我们从广东甘蔗种质资源圃随机挑选了1份来自福建惠安的割手密作为对照，结果表明福建惠安的割手密和广东地区67割手密的平均遗传距离为0.222 5，比广东省内地割手密之间的平均遗传距离高15%，由此可见，地理差异对割手密的遗传关系具有一定的影响。

UPGMA聚类分析表明在遗传距离约为0.012时，可将68份材料划分为9大类。来自福建的1份材料单独聚为1类，来自广东的材料聚为8类(图1)。其中类Ⅰ、类Ⅱ中都只有1份材料，分别为来自广东揭阳的广东2号和来自福建的惠安割手密。类Ⅲ中共有5份材料，分别来自广东的三水、五华、博罗、海丰等地。类Ⅳ中共有两份材料，分别来自于韶关和揭阳。类Ⅴ中也只有两份材料，来自于三水和肇庆。类Ⅵ中共有14份材料，来源地比较广泛、从南到北都有。类Ⅶ中也只有1份材料，为来自湛江的广东81号。类Ⅷ是最大类群，共有35份材料，来源地也是比较分散。类Ⅸ中共有8份材料，分别来自于三水、高要、开平、阳江、肇庆等地。

图1 基于Nei's 遗传距离的割手密UPGMA聚类图 Figure 1 UPGMA dendrogram for Guangdong S. spontaneum based on Nei's genetic distance

从聚类结果看，地理来源在割手密类群的划分中起到了一定的决定性作用。本实验中唯一的1份省外来源的福建割手密单独聚为1类。在广东省内材料的8个类群中，类Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ中因为只有1~2份材料，材料数较少，和地理之间的遗传关系难以判断。在材料较多的类Ⅲ、Ⅵ、Ⅷ、Ⅸ中，类Ⅸ中8份材料处1份来自于广东南部的阳江地区，其他7份都来自于中部地区。类Ⅲ、Ⅵ、Ⅷ中虽然每一类群中都包含有来自不同地区的材料，但每个大类下地理相同或相近的材料又形成不同的亚类。例如在类Ⅵ中，共有14份材料，从聚类图可以看出，这14份材料又可以分为三个亚类。Ⅵ-ⅰ亚类中，除了广东55号来自于广东中部地区的德庆外，其他6份材料广东68号、广东3号、广东11号、广东6号、广东4号和广东7号都是来源于粤北的英德、从化、花都等地区，该亚类可定义为粤北类型。Ⅵ-ⅱ中包括广东61号、广东14号、广东17号、广东13和广东16号5份材料，这5份材料中1份来源于清远，其他四份都来源于广东中部地区的三水、博罗地区，因此这个亚类可定义为粤中类型。而Ⅵ-ⅲ亚类中的两份材料广东78号和广东82号分别来源于广东南部的遂溪、海康地区，因此该亚类可定义为粤南类型。由此可见，类Ⅵ中的材料可清楚的划分为粤北、粤中和粤南三个亚类。此外，类Ⅲ、Ⅷ中在其他类群中也有相似的现象，如类群Ⅷ中，广东36、广东40、广东41和广东42分别来源于梅州、龙川和河源三地，这三个地方在地理上也都属于粤北地区。这4份材料在类群三种可单独划分为1个小的亚类。类Ⅲ中广东28号和广东29号都是来自于海丰，这两份材料间的遗传关系也最近。由此可见，地理因素在广东割手密种质资源遗传结构的形成上起到了一定的决定作用，广东割手密由南到北存在明显的地理分化。

2讨论
广东是中国割手密的重要分布地区之一，受工农业经济的发展，割手密的生存范围和种质资源的数量正在迅速的减少，因此迫切需要加强收集和保护。本研究通过两种不同类型的SSR分子标记对来自广东不同地区的割手密材料进行分析，从研究结果看，广东地区的割手密存在着丰富的遗传变异，平均每个SSR引物上的多态性17.05，但是平均遗传多样性指数只有0.193 4，说明各个地区来源的割手密之间遗传差异较小。杨生超等(2004; 2005)研究表明在甘蔗的近缘物种中，割手密光和特性对光强、温度的变化最为敏感。本实验也发现地理来源是形成广东割手密遗传结构的重要因素，地理来源相同或相近的材料更易聚为一类，而且部分类群中的材料可清楚的分为南、中、北3中类型。广东从南向北差异最为显著的就是温度、光照等生态因素。由此可见，受光照、气温等因素的影响，割手密在不同的地理环境条件下通过长期进化形成了不同的生态型。这与Chang等(2012)在四川割手密遗传多样性上的研究的结果也非常相似。因此，在今后割手密种质资源收集和利用时要重点考虑材料生存地的环境条件等因素。

与农艺性状相比，分子标记具有稳定、简便等特点，已经成为植物种质资源保护和开发利用的重要技术手段(Qi et al., 2009; Andru et al., 2011)。目前，在甘蔗中已经开发出了许多Genomic-SSR和EST-SSR (Marconi et al., 2011; Pinto et al., 2004)，但是关于这两种类型的SSR在割手密种质资源评价的应用效果比较还没有报道。从本研究结果看，Genomic-SSR比EST-SSR具有更高的多态性条带，但是EST-SSR具有更高的遗传多样性指数和多态性信息含量。这可能是EST-SSR处于基因内部，保守性强，主要等位基因在各个地区分布更为均匀。因此，表现出了较高的遗传多样性。但是，尽管两种类型SSR有所差异，通过两种不同类型SSR获得的材料间遗传距离矩阵之间存在极显著相关，说明在进行种质资源遗传关系评价时两种类型SSR应用效果相似，可根据两种类型引物的特点针对不同的实验目的选择相应的引物。

3材料与方法
3.1实验材料
实验材料共68份，其中67份为采集于广东不同地区的割手密，1份为采集地为福建惠安的福建割手密(表1)。

3.2 DNA提取
采用CTAB法，参照Besse等方法(Besse et al., 1996)，利用幼嫩叶片提取DNA。通过0.8%的琼脂糖凝胶电泳测定DNA质量，用紫外分光光度计测量DNA浓度。

3.3 SSR分析
本实验共采用20对SSR引物进行分析。根据国际甘蔗生物技术学会(International Consortium of Sugarcane Biotechnology)公布的SSR的引物信息选择了10对基因组SSR (Cordeiro et al., 2000; Pan, 2006)。根据Pinto等(2004)研究选择了20对EST-SSR，经过PCR与聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，筛选出10对条带清晰、分子量适中的引物(表2)。

表2 实验材料名称及来源地 Table 2 Name and origin of the materials used in this study

PCR扩增程序为反应体系为每20 μL反应体积中含有DNA模板50 ng、10×Buffer 2.0 μL、MgCl₂ 2.0 mmol/L、上游引物和下游引物各0.25 mmol/L、dNTP 0.2 mmol/L、Taq酶1.5 U。反应程序为：95℃下预变性5 min后，然后进行30个循环，每个循环包括：95℃ 1 min、55℃ 30 s、72℃ 1 min，最后在72℃下延伸10 min。扩增产物进行银染显色(Bassam et al., 1991)。

3.4统计分析
统计每对引物扩增的带条数，有带记作l，无带记作0。应用PowerMarker V3.0软件(Liu and Muse, 2005)统计每个引物上的多态性条带数、遗传多样性指数(Weir, 1996)和平均多态性信息含量(Botstein et al., 1980)，计算各个材料间的Nei's遗传距离(Nei, 1973)，然后再根据各个材料间的遗传距离进行UPGMA聚类分析。

作者贡献
樊丽娜是本研究的实验设计和实验研究的主要执行人；李昱，罗青文，劳方业，王勤南，何慧怡及陈月桂参实验研究与数据分析；邓海华、李奇伟参与实验设计，试验结果分析；齐永文是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由国家自然科学基金(30800700)、国家现代农业产业技术体系(CARS-20-1-4)、广东省科技计划(2011B060400019)共同资助。

参考文献
Amalraj V.A., Balakrishnan R., Jebadhas A.W., and Balasundaram N., 2006, Constituting a core collection of Saccharum spontaneum L. and comparison of three stratified random sampling procedures, Genet. Resour. Crop Ev., 53(8): 1563-1572
http://dx.doi.org/10.1007/s10722-005-8510-5

Andru S., Pan Y.B., Thongthawee S., Burner D.M., and Kimbeng C.A., 2011, Genetic analysis of the sugarcane (Saccharum spp.) cultivar ‘LCP 85-384’. I. linkage mapping using AFLP, SSR, and TRAP markers, Theor. Appl. Genet., 123(1): 77-93
http://dx.doi.org/10.1007/s00122-011-1568-x
PMid:21472411

Bassam B.J., Caetano-Anolles G., and Gresshoff P.M., 1991, Fast and sensitive silver staining of DNA in polyacrylamide gels, Anal. Biochem., 80: 80-83
http://dx.doi.org/10.1016/0003-2697(91)90120-I

Besse P., Mcintyre C.L., and Berding N., 1996, Ribosomal DNA variations in Erianthus, a wild sugarcane relative andropogoneae-Saccharinae, Theor. Appl. Genet., 92(6): 733-743
http://dx.doi.org/10.1007/BF00226096

Botstein D., White R.L., Skolnick M., and Davis R.W., 1980, Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms, Am. J. Hum. Genet., 32: 314-331
PMid:6247908 PMCid:1686077

Bremer G., 1961, Problems in breeding and cytology of sugar cane, Euphytica, 10(1): 59-78
http://dx.doi.org/10.1007/BF00037206

Chang D., Yang F.Y., Yan J.J., Wu Y.Q., Bai S.Q., Liang X.Z., Zhang Y.W., and Gan Y.M., 2012, SRAP analysis of genetic diversity of nine native populations of wild sugarcane, saccharum spontaneum from Sichuan, China., Genet. Mol. Res., 11(2): 1245-1253
http://dx.doi.org/10.4238/2012.May.9.3
PMid:22614352

Chen S.L., and Phillips S.M., 2006, 187. saccharum linnaeus, Sp.P1.1:54.1573., In: Wu Z.Y., Raven P.H., and Hong D.Y., (eds.), Flora of China Vol.22 (Poaceae), Science Press, Beijing, and Missouri Botanical Garden Press, St. Louis., pp.576-581

Cordeiro G.M., Taylor G.O., and Henry R.J., 2000, Characterisation of microsatellite markers from sugarcane (Saccharum spp.), a highly polymorphic species, Plant Sci., 155(2): 161-168
http://dx.doi.org/10.1016/S0168-9452(00)00208-9

Deng H.H., Li Q.W., and Chen Z.Y., 2004, Breeding and utilization of new sugarcane parents, Ganzhe (Sugarcane), 11(3): 7-12 (邓海华, 李奇伟, 陈子云, 2004, 甘蔗亲本的创新与利用, 甘蔗, 11(3): 7-12)

D' Hont A., Grivet L., Feldmann P., Rao S., Berding N., and Glazmann J.C., 1996, Characterization of the double genome structure of modern sugarcane cultivars (Saccharum spp.) by molecular cytogenetics, Mol. Gen. Genet., 250(4): 405-413
http://dx.doi.org/10.1007/BF02174028

Grivet L., D'Hont A., Roques D., Feldmann P., Lanaud C., and Glaszmann J.C., 1996, RFLP mapping in cultivated sugarcane (Saccharum spp.): genome organization in a highly polyploid and aneuploid interspecific hybrid, Genetics, 142(3): 987-1000
PMid:8849904 PMCid:1207035

Lao F.Y., Liu R., He H.Y., Deng H.H., Chen Z.H., Chen J.W., Fu C., Zhang C.M., and Yang Y.H., 2008, AFLP analysis of genetic diversity in series sugarcane parents developed at HSBS, Fenzi Zhiwu Yuzhong (Molecular Plant Breeding), 6(3): 517-522 (劳方业, 刘睿, 何慧怡, 邓海华, 陈仲华, 陈健文, 符成, 张垂明, 杨业后, 2008, 崖城系列甘蔗亲本遗传多样性的AFLP标记分析, 分子植物育种, 6(3): 517-522)

Liu K., and Muse S.V., 2005, PowerMarker: an integrated analysis environment for genetic marker data, Bioinformatics, 21(9): 2128-2129
http://dx.doi.org/10.1093/bioinformatics/bti282
PMid:15705655

Marconi T.G., Costa E.A., Miranda H.R., Mancini M.C., Cardoso-Silva C.B., Oliveira K.M., Pinto L.R., Mollinari M., Garcia A.A.F., and Souza A.P., 2011, Functional markers for gene mapping and genetic diversity studies in sugarcane, BMC Research, 4: 264
http://dx.doi.org/10.1186/1756-0500-4-264
PMid:21798036 PMCid:3158763

Mary S., Nair N.V., Chaturvedi P.K., and Selvi A., 2006, Analysis of genetic diversity among Saccharum spontaneum L. from four geographic regions in India, using molecular markers, Genet. Resour. Crop Ev., 53: 1221-1231
http://dx.doi.org/10.1007/s10722-005-2433-z

Nei M., 1973, Analysis of gene diversity in subdivided populations, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 70(12): 3321-3323
http://dx.doi.org/10.1073/pnas.70.12.3321

Pan Y.B., 2006, Highly polymorphic microsatellite DNA markers for sugarcane germplasm evaluation and variety identity testing, Sugar Tech, 8(4): 246-256
http://dx.doi.org/10.1007/BF02943564

Pan Y.B., Burner D.M., Legendre B.L., Grisham M.P., and White W. H., 2004, An assessment of the genetic diversity within a collection of Saccharum spontaneum L. with RAPD-PCR, Genet. Resour. Crop Ev., 51(8): 895-903
http://dx.doi.org/10.1007/s10722-005-1933-1

Pinto L.R., Oliveira K.M., Ulian E.C., Garcia A.A., and de Souza A.P., 2004, Survey in the sugarcane expressed sequence tag database (SUCEST) for simple sequence repeats, Genome, 47(5): 795-804
http://dx.doi.org/10.1139/g04-055
PMid:15499394

Qi Y.W., Fan L.N., He H.Y., Chen Y.S., Ao J.H., and Deng H.H., 2009, Genetic diversity assessment of Saccharum spontaneum L. native to guangdong area with agronomic traits, Ganzhe Tangye (Sugarcane and Canesugar), (3): 7-11 (齐永文, 樊丽娜, 何慧怡, 陈勇生, 敖俊华, 邓海华, 2009, 广东割手密资源农艺性状遗传多样性评价, 甘蔗糖业, (3): 7-11)

Qi Y.W., Zhang H.L., Zhang D.L., Wang M.X., Sun J.L., Ding L., Wang F.H., and Li Z.C., 2009, Assessing indica-japonica differentiation of improved rice varieties using microsatellite markers, J. Genet. Genomics, 36(5): 305-312
http://dx.doi.org/10.1016/S1673-8527(08)60119-8

Sreeinivasan T.V., Ahloowalia B.S., and Heinz D.J., 1987, Cytogenetics, In: Heinz D.J. (ed.), Sugarcane improvement through breeding, Elsevier, Amsterdam, pp.211-253

Tai P.Y.P., and Miller J.D.A., 2001, A core collection for Saccharum spontaneum L. from the world collection of sugarcane, Crop Sci., 41: 879-895
http://dx.doi.org/10.2135/cropsci2001.413879x

Weir B.S., ed., 1996, Genetic data analysis Ⅱ, Sinauer Associates, Inc., Sunderland, Massachusetts, pp.150-156

Yang Q.H., and He S.C., 1993, Studies on Saccharum spontaneum chromosome numbers and geographical distribution in Yunnan, China, Ganzhe (Sugarcane), 3(1): 10-13 (杨清辉, 何顺长, 1993, 云南割手密(Saccharum spontaneum)染色体数目及其地理分布研究, 甘蔗, 3(1): 10-13)

Yang S.C., Yang Q.H., Li F.S., and Xiao G.L., 2005, Relations between photosynthesis characteristics of the wild germplasmic plants in sugarcane complex and annualmean temperature where their were collected, Zhongzi (Seed), 7; 9-14 (杨生超, 杨清辉, 李富生, 肖关丽, 2005, 甘蔗野生种质植物光合特性与原生长地年平均气温关系, 种子, 7: 9-14)

Yang S.C., Yang Q.H., Li F.S., and Xiao G.L., 2004, The relations between photosynthesis characteristics of the wild germplasmic plant s in sugarcane complex with its annual mean light intensity where they were collected, Zhongzi (Seed), 23(8): 5-8 (杨生超, 杨清辉, 李富生, 肖关丽, 2004, 甘蔗野生种质植物光合特性与原生长地年平均光强的关系, 种子, 23(8): 5-8)

Zhang G.M., Li Y.R., He W.Z., He H., Liu X.H., Song H. Z., Liu H.B., Zhu R.C., and Fang W.K., 2010, Analysis of the genetic diversity in Saccharum spontaneum L. accessions from Guangxi province of China with RAPD-PCR, Sugar Tech, 12(1): 31-35
http://dx.doi.org/10.1007/s12355-010-0007-7

Zhang Q., Qi Y.W., Zhang C.M., Chen Y.S., and Deng H.H., 2009, Pedigree analysis of genetic relationship among core parents of sugarcane in Mainland China, Guangdong Nongye Kexue (Guangdong Agricultural Science), 10: 44-48 (张琼, 齐永文, 张垂明, 陈勇生, 邓海华, 2009, 我国大陆甘蔗骨干亲本亲缘关系分析, 广东农业科学, 10: 44-48)